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Una enzima de restricción es una enzima que puede reconocer una secuencia característica del enzima de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto llamado sitio o diana de restricción. Las dianas de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, que suelen ser capicúas

También conocidas como Endonucleasas de Restricción, lo que hacen realmente es romper 2 enlaces fosfodiester en la doble cadena, dando lugar a dos extremos del DNA, que pueden ser Romos( cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos / escalonados. Estos últimos tienen más tendencia a volver a unirse de modo espontáneo utilizando los puentes de hidrógeno entre las bases ( Apareamiento de Watson & Crick)

Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas. Conocemos así el ADN vector, que sería aquel que es capaz de replicarse independientemente del ADN de la célula anfitriona en la cual crece. Dentro de este grupo de vectores están los Plásmidos moléculas circulares de ADN halladas en las bacterias.

Estas enzimas se encuentran en muchas especies de bacterias, donde funcionan in vivo como parte de un sistema de restricción y modificación (sistema R/M). Este sistema es análogo a un sistema inmune, y le permite distinguir a la bacteria entre su propio ADN y el ADN exógeno, siendo este último degradado por la enzima de restricción. El ADN propio no es reconocido por sus enzimas de restricción, puesto que previamente lo ha modificado por metilación a través de la acción de una metiltransferasa (enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosilmetionina a bases específicas).

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