Teniendo en cuanta que la determinación de la actividad de las enzimas de la miel está adquiriendo cada vez mayor importancia como una forma de valorar su calidad y que la diastasa es una de las enzimas cuya determinación analítica sólo se realiza en ciertos laboratorios que no siempre están al alcance de los productores, es imprescindible disponer de un método simple para aquellos que no cuentan con la implementación cómoda de un laboratorio y quieren determinar la cantidad aproximada de diastasa, a fin de poder valorar la calidad de la miel.
Es así que se ha puesto un nuevo método simple que no requiere instrumental complicado y es de fácil realización. En este procedimiento, el sustrato de almidón se incuba con la muestra de miel y se produce la hidrólisis enzimática la cual se determina por el agregado del reactivo yodo que produce coloración con el remanente de almidón no hidrolizado. La disminución del color que ocurre en los tubos del desconocido después de incubarlo, respecto del tubo control, es una medida de la actividad diastasa de la muestra, que se expresa en unidades de diastasa.
Principio del método propuesto[]
El sustrato de almidón tamponado se incuba con la muestra y se produce la hidrólisis enzimática; esta última se determina por el agregado del reactivo yodo el cual produce coloración con el remanente del almidón no hidrolizado.
Reactivos[]
- 1
- Buffer acetato - pH 5,3 (1,59 M):
- Acetato de sodio - 3H2O----87 g
- Ácido acético glacial------10,5 ml.
- Agua destilada c.s.p.-----500 ml.
Disolver el acetato de sodio en 400 mililitros de agua, añadir el ácido acético disuelto en un poco de agua y completar hasta 500 mililitros.
Ajustar el pH a 5,3 con acetato de sodio o ácido acético, según el caso, utilizando un pH-metro.
- 2)
- Solución de cloruro de sodio 1 %:
- Cloruro de sodio ----------1 g.
- Agua destilada c.s.p.----100 ml.
Disolver el cloruro de sodio p.a. en agua destilada hervida y completar a volumen. El tiempo de conservación está limitado por la formación de mohos.
- 3)
- Solución de almidón:
- Almidón soluble-------------0,050 g.
- Agua destilada c.s.p.-----100 ml.
Pesar, en una balanza analítica, en un vaso de precipitación de 50 mililitros, el almidón soluble y disolverlo en 10 mililitros de agua destilada fría. Luego pasarlo a una vaso de precipitación de 100 mililitros con ayuda de agua destilada y llevarlo a un volumen de 70 mililitros con agua destilada caliente.
Someter al calentamiento y mantenerlo en ebullición por tres minutos; dejar enfriar espontáneamente y, una vez frío, pasarlo a un matraz aforado de 100 mililitros y completar el volumen con agua destilada.
Preparar una solución nueva días alternos.
- 4)
- Solución de yodo 0,1 N:
- Yoduro de potasio--------20 g
- Yodo---------------------12,7 g
- Agua destilada c.s.p.--1000 ml.
Se disuelve el yoduro de potasio libre de yodato p.a. en 30 ó 40 mililitros de agua en un matraz aforado de un litro con tapa esmerilada. Se pesa el yodo p.a. resublimado sobre vidrio de reloj en una balanza común y se pasa, mediante un embudo pequeño y seco, al matraz aforado que contiene la solución concentrada de yoduro de potasio.
Se tapa el matraz y se agita hasta que el yodo se haya disuelto.
La solución se deja en reposo unos 20 minutos para que tome la temperatura ambiente, se lleva a volumen con agua destilada y se homogeneiza.
La solución de yodo se conserva bien en frascos pequeños, en lugar frío y oscuro.
- 5)
- Solución de floruro de sodio:
- Floruro de sodio 2g
- Agua destilada c.s.p.-100 mililitros
Disolver el floruro de sodio en 30 ó 40 mililitros de agua destilada en un vaso de precipitación, trasvasar a un matraz aforado de 100 mililitros y completar a volumen.
- 6)
- Solución de trabajo
- de yodo 0,01 N:
- Solución de yodo ————— 1 parte
- Solución de floruro de sodio — 9 partes
Mezclar ambas soluciones. La solución se conserva bien en un frasco pequeño y oscuro en la heladera.
Material necesario
- 1- Balanza
- 2- Baño María
- 3- Tubos de ensayo
- 4- Gradilla para tubos de ensayo
- 5- Pipetas
- 6- Vaso de precipitación
- 7- Instrumental de laboratorio
Preparación de la muestra - Procedimiento[]
Pesar dos gramos de la muestra de miel en un vaso de precipitación de 50 mililitros, añadir un mililitro de buffer pH 5,3 y mezclar con una varilla de vidrio.
- 1- Colocar en una gradilla 10 tubos de ensayo y agregarle a cada uno un mililitro de solución de cloruro de sodio al uno por ciento.
- 2- Agregar al primer tubo un mililitro de la muestra y mezclar por aspiración y expulsión con una pipeta.
- 3- Pasar luego un mililitro del primer tubo al segundo, mezclar y continuar así hasta el noveno tubo; desechar el último mililitro
- 4- El tubo décimo sirve de testigo.
- 5- Colocar a cada tubo un mililitro de solución de almidón 0,050 por ciento e incubar por 30 minutos a 37 grados centígrados.
- 6- Retirar, enfriar rápidamente y colocar una gota de solución de trabajo de yodo a cada tubo y agitar. Observar la coloración.
Cálculo y expresión de los resultados[]
U.D. (dilución mayor que permanece incolora) x 2.
Diluciones
- Tubo nº 1: dilución------- 1/2
- Tubo nº 2: dilución------- 1/4
- Tubo nº 3: dilución------- 1/8
- Tubo nº 4: dilución------- 1/16
- Tubo nº 5: dilución------- 1/32
- Tubo nº 6: dilución------- 1/64
- Tubo nº 7: dilución------- 1/128
- Tubo nº 8: dilución------- 1/256
- Tubo nº 9: dilución------- 1/512
Ejemplo Si el tubo cinco es el último incoloro tenemos: 32 x 2 = 64 U.D. Valor normal: No menos de 32 U.D.
Interpretación.[]
Normalmente los valores están entre 32 y 128 U.D. Cantidades menores de 32 U.D. corresponden a una miel vieja, o miel calentada, miel mal procesada o miel adulterada.
Existen mieles con bajo contenido natural de diastasa como las miel de citrus, por ejemplo.
TABLA DE CORRELACIÓN ENTRE U.D. DEL MÉTODO PROPUESTO POR EL AUTOR Y EL I.D. QUE CORRESPONDE AL NÚMERO DE LA ESCALA DE GOTHE
- U.D. I.D.
- MÍNIMO MÁXIMO PD*
- 0 - 0,99 - 2,88 - 2,05
- 4 - 2,93 - 4,16 - 3,54
- 8 - 4,32 - 5,70 - 5,04
- 16 - 7,28 - 8,08 - 7,69
- 32 - 9,01 - 14,68 - 12,11
- 64 -15,22 - 27,25 - 18,80
- 128 -33,48 - 67,87 - 45,53